L’électrophorèse sur gels d’agarose ou de polyacrylamide est l’une des méthodologies les plus utilisées en laboratoire pour tout ce qui concerne le travail avec les acides nucléiques. Grâce à l’électrophorèse, nous pouvons séparer les fragments d’ADN et d’ARN en fonction de leur taille, les visualiser au moyen d’une simple coloration et ainsi déterminer la teneur en acides nucléiques d’un échantillon, en ayant une estimation de leur concentration.
La technique d’électrophorèse sur gel utilise la différence de taille et de charge de différentes molécules dans un échantillon. L’échantillon d’ADN, d’ARN ou de protéine à séparer est chargé fixé sur un gel poreux placé dans un environnement ionique du tampon. Dans l’utilisation de la charge électrique, chaque molécule qui a une taille et une charge différentes se déplacera à travers le gel à des vitesses différentes.
Le gel poreux utilisé dans cette technique agit comme un tamis moléculaire qui sépare les plus grosses molécules des plus petites. Les petites molécules se déplacent plus rapidement à travers le gel tandis que les plus grosses sont laissées pour compte. La mobilité des particules est également contrôlée par leur charge électrique individuelle.
Comment se déroule l’électrophorèse sur gel ?
Le gel utilisé en électrophorèse sur gel est généralement constitué d’un matériau appelé agarose, qui est une substance gélatineuse extraite d’algues, ou encore de polyacrylamide. Ce gel poreux peut être utilisé pour séparer des macromolécules de différentes tailles. Le gel est immergé dans une solution tampon dans une chambre d’électrophorèse. Le tris-borate-EDTA (TBE) est couramment utilisé comme tampon. Sa fonction principale est de contrôler le pH du système. La chambre a deux électrodes – une positive et une négative – à ses deux extrémités.
Les échantillons à analyser sont ensuite chargés dans de minuscules puits sur le gel à l’aide d’une pipette. Une fois la charge terminée, un courant électrique de 50-150 V est appliqué. Maintenant, les molécules chargées présentes dans l’échantillon commencent à migrer à travers le gel vers les électrodes. Les molécules chargées se déplacent vers l’électrode positive et les molécules chargées migrent négativement vers l’électrode négative.
La vitesse à laquelle chaque molécule se déplace à travers le gel s’appelle sa mobilité électrophorétique et est principalement déterminée par sa charge nette et sa taille. Les molécules fortement chargées se déplacent plus rapidement que les molécules faiblement chargées. Les petites molécules courent plus vite, laissant derrière elles les plus grosses. Ainsi, une charge forte et une petite taille augmentent la mobilité électrophorétique d’une molécule, tandis qu’une charge faible et une grande taille diminuent la mobilité d’une molécule.
Une fois la séparation terminée, le gel est coloré avec un colorant pour révéler les bandes de la séparation. Le bromure d’éthidium est un colorant fluorescent couramment utilisé en électrophorèse sur gel. Le gel est trempé dans une solution diluée de bromure d’éthidium puis placé dans un transilluminateur UV pour visualiser les bandes de séparation. Les bandes sont immédiatement examinées ou photographiées pour référence future, car elles se diffuseront dans le gel au fil du temps.
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